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基于抗體的治療方法是治療疾病的有力工具。盡管該方法的作用機制始終涉及抗體的Fab 區(qū)域與特異性靶標相結合，但是通過抗體Fc區(qū)域誘導的效應功能也是同樣重要的?？贵w治療通過抗體的Fc區(qū)域與免疫細胞或補體表面的Fcγ受體（FcγR）相結合而發(fā)揮治療作用，如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)和補體依賴性毒性(CDC)，兩者均可誘導靶細胞死亡，并有助于治療效果。
另一種主要的Fc效應功能是抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)。ADCP的機制是抗體作用的靶細胞激活巨噬細胞表面上的FcγR機制，誘導吞噬，使靶細胞內化和被吞噬體酸化降解。ADCP被認為是幾種生物制劑的主要作用機制，但是其活性卻很難在體外進行檢測。本文介紹主要介紹流式檢測ADCP活性的方法。
原文標題：A novel method for determining antibody-dependent cellular phagocytosis
作者：Lynn Kamena, et al.
來源：Journal of Immunological Methods, 2019.
部分翻譯：土豆胖嘟嘟
使用靶向抗體激活免疫系統(tǒng)殺死腫瘤細胞一直是一個有效的治療手段。B淋巴細胞表面的CD20是腫瘤免疫治療的最初靶標之一。利妥昔單抗是第一個獲批的抗CD20的治療藥物，臨床數(shù)據(jù)表明其可激活免疫系統(tǒng)誘導B細胞耗竭。利妥昔單抗的Fc區(qū)域與免疫細胞的Fcγ受體相結合，使免疫細胞被激活，通過ADCC路徑裂解B細胞。Fcγ受體的參與也可通過ADCP途徑內化和裂解靶標細胞。
與ADCC一樣，抗體作用的靶細胞被表達Fcγ受體的免疫細胞所識別。涉及吞噬作用的原發(fā)性免疫細胞是巨噬細胞，其表面Fcγ受體的交聯(lián)作用導致細胞內信號通路被激活，進而引起靶細胞內吞。細胞內的吞噬體沿著高度可調控的成熟路徑進行作用，該路徑會表達特異性膜蛋白如Rab5和LAMP-1，以及會逐漸酸化吞噬體直到與溶酶體融合最終降解內化細胞。
FcγR介導的吞噬作用不僅可以應對感染，還可以在腫瘤治療方面提供重要的治療功能。巨噬細胞可通過ADCP來內化和吞噬腫瘤細胞。以前的工作表明，一些單克隆抗體，包括靶向腫瘤抗原的抗體，如HER2，Ep-CAM，CD40，CD30和MUC-1，可在體外誘導吞噬作用。因此這種機制被認為是體內抗體介導清除腫瘤細胞的主要作用機制。
1.以人外周血為樣本，利用磁珠分選試劑盒進行單核細胞分選。將分選后的單核細胞培養(yǎng)在巨噬細胞分化培養(yǎng)基(RPMI 1640, 10% FBS, 8% human serum, 20mM HEPES, 1% Glutamax, 1% penicillin/streptomycin, and 50 ng/mL M-CSF)中，37 °C, 5% CO2培養(yǎng)5-6天。
用表1的抗體進行染色，來觀察單核細胞和分化后的巨噬細胞Fcγ受體和CD14的表達情況。
結果如上圖，與單核細胞相比，分化后巨噬細胞的CD14和三種類型的Fcγ受體表達量均有所增加，提高了介導ADCP的潛能。
2.巨噬細胞用Cell Trace Violet(Thermo Fisher Scientific)染料進行標記；靶標細胞用pHrodo(Thermo Fisher Scientific)進行標記，然后分別重懸于ADCP 實驗緩沖液中(RPMI-1640, 10% FBS, 25mM HEPES, 1% Glutamax, 1% penicillin/streptomycin)，最后以靶標細胞：效應細胞是2：1的比例進行混勻，37 °C, 5% CO2條件下孵育4.5h，流式分析結果。
結果如上所示，被吞噬的細胞包含在細胞囊泡中，囊泡的酸性會逐漸增加。利用吞噬體的PH特性和pHrodo染料的PH敏感性來檢測真正被內化的細胞，降低非特異性結合導致的干擾。
通過流式分析吞噬作用，圈門策略是通過大小和粒度找到活細胞群，然后畫門圈定Cell Trace Violet陽性的巨噬細胞，最后分析pHrodo熒光素的強弱來了解吞噬作用。從結論可以看出，通過PH敏感試劑(pHrodo)標記靶標細胞來定量分析細胞吞噬作用的方法是比較可靠的，該方法具有高度可重復性。
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